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组合一
a.细菌回复突变试验
b.体外染色体畸变试验或体外微核试验或体外小鼠淋巴瘤tk试验,这三个试验可以任选其中一个。
c.体内微核试验或体内骨髓细胞染色体畸变试验;动物给药后取外周血淋巴细胞做细胞遗传学分析也可接受,但不常用。
组合二
a.细菌回复突变试验
b.用两种不同组织做体内遗传毒性评估,通常包含体内微核试验和另一个体内试验。第二个体内试验通常选择评估动物肝脏DNA链断裂。
细菌回复突变试验是与致癌物检测最相关的体外试验。
实验类型 | 培养器皿 | 实验时间 | 受试物用量 |
标准Ames | 100mm细胞培养皿 | 两周 | 400mg |
Mini-Ames | 六孔细胞培养板 | 1周 | (1)80mg测试五个菌株 (2)30mg测试两个菌株 |
Micro-Ames | 24孔细胞培养板 | 1周 | 15mg |
Amesll | 384孔板 | 1周 | < 5mg |
GLP试验用标准Ames试验。
在药物筛选早期常用的试验有Mini-Ames试验、Micro-Ames试验、AmesII试验等,特点是用药量少。
Mini/Micro Ames试验通常选择2个菌株(即TA98和TA100,可检测98%致突变剂),为了消除另外2%的可能性,可选择与标准Ames试验相同的5个菌株。
AmesII试验使用菌株TA98和混合菌株TA7001至7006,将细菌与受试物预培养及一系列稀释后,在30℃培养过夜,然后接种到各有选择性试剂5-FU及pH敏感剂溴甲酚紫的384孔上,通过紫外分光光度计检测培养基变黄的程度来判断受试物致突变性。
受试物 | 浇到平板,孵育48-72小时 | ||
菌液 | |||
S9混合物/PBS |
应选择至少5种菌株
每种菌株在编码组氨酸/色氨酸生物合成的操纵子上有不同的突变。
国外较多实验室选用WP2,而国内使用TA102较多。
菌株 | 氨基酸标记物 | 其它相关突变 | 质粒 | |||
突变基因 | 突变类型 | 主要基因靶点 | 膜突变 | DNA修复 | ||
TA1535 | hisG46 | 碱基置换 | GC | rfa | UVrB | - |
TA1537 | hisC3076 | 移码 | GC | rfa | UVrB | - |
TA97 | hisD6630 | 移码 | GC | rfa | UVrB | pKM101 |
TA97a | hisD6631 | 移码 | GC | rfa | UVrB | pKM101 |
TA98 | hisD3052 | 移码 | GC | rfa | UVrB | pKM101 |
TA100 | hisG46 | 碱基置换 | GC | rfa | UVrB | pKM101 |
WP2 uvrA | trpE | 碱基置换 | AT | - | UVrA | - |
WP2 uvrA(pKM101) | trpE | 碱基置换 | AT | - | UVrA | pKM101 |
TA102 | hisG428 | 碱基置换 | AT | rfa | + | pKM101pAQ1 |
Rfa膜突变的存在增加了细胞膜对大分子化学物质的通透性
uvrB-菌株的切除修复功能有缺陷,菌株无法切除DNA加合物,是的这些菌株对大量致突变剂的致突变性和细菌毒性敏感。
质粒pKM101上含有muc+基因,参加DNA损伤诱导的DNA修复途径,在给予细菌抵抗致突变剂的细菌毒性同时,提高了易突变性。含有质粒pKM101的菌株自发回复突变菌落数较高。
TA1537、TA97和TA97a均含有胞嘧啶的重复序列,位于相应的组氨酸靶位点内的突变敏感部位,他们对导致这些移码热点中碱基缺失的移码诱变剂的敏感性相似。
TA98和TA100对大部分致突变剂敏感(有数据显示这两个菌株检测阳性的致突变剂占98%,因而在前期筛选试验中可只检测这两个菌株。)
羟基蒽醌类化合物仅可被菌株TA1537检测
氧化型突变剂、DNA交联剂剂联氨仅可被含有AT位点突变的菌株TA102、WP2urA、WP2uvrA(pKM101)检测
菌株TA1535与TA100都在hisG46基因位点发烧碱基置换型突变,不同点仅是TA100含有pKM101质粒,从而增加突变敏感性。但是专家组通过大量数据显示,在已知的659种致突变剂中约5%受试物仅可被TA1535检测出,而不是TA100。
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